RPMI 1640 细胞培养液的配制

1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节 pH 值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。 2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培 养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌） 。 3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量 1/3 的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养 液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。 4) 补加试剂： 根据包装袋说明和试验需要加入 NaHCO3 2.0g） 谷氨酰胺、 （ 、 丙酮酸钠、 HEPES 等其他试剂。 5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素 100U/ml，链霉素 100U/ml。市售青霉素为 80 万 U／瓶，可溶于 4ml 体积，每一升培养液中加 0.5ml 即可。市售链霉素为 100 万 U／ 瓶，可溶于 5ml 体积，每一升培养液中也加 0.5ml 即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代 替，终浓度调为 50～200U/ml。 6) 调 pH 值：加水到 900ml（在需要加 10％小牛血清的情况下） ，然后用 5％ NaHCO3 调节 pH 到 7.2。 7) 过滤除菌：宜采用 0.45um 和 0.22um 滤膜各一张，上层为 0.45um，下层为 0.22um，以保 证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100 或 200ml） 。 8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃） 。临用前将加入 小牛血清(10%~20%)。

【注意事项】 每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也 可以同时配制，分别过滤。 市售小牛血清使用前多应该灭活（56℃，30min） ，以消除补体活性。动物血清个体差异大， 故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶 血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量 3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于 2g／ 100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。 由于市售小牛血清 pH 未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的 pH 可能还会 变化，故亦可先加入小牛血清后调 pH 值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。 培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于 37℃温箱内置 24～48hr，以检测培养液是

否有污染。 每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失， 造成实验繁琐或者污染。